بررسی تنوع ژنتیکی جدایه هایpaecilomyces variotii عامل سر خشکیدگی پسته براساس نواحی rdna-its با استفاده از نشانگر pcr-rflp در استان کرمان

سرخشکیدگی یکی از بیماری های مخرب پسته در استان کرمان است که توسط قارچ paecilomycesvariotii ایجاد می شود. برای تعیین تنوع ژنتیکی و توالی یابی ژنوم این گونه، نمونه برداری به صورت تصادفی از 7 منطقه استان کرمان انجام گرفت. نمونه ها بر روی محیط کشت pda کشت داده شد. به دنبال آن با روش نوک هیف عمل خالص سازی انجام گردید و تعداد 116 جدایه جداسازی و در نهایت تعداد 28 جدایه برای مطالعات بعدی مورد استفاده قرار گرفت. جدایه ها بر روی محیط کشت pda دارای رنگ پرگنه متنوع و عموماً به رنگ زیتونی روشن تا زیتونی تیره و یا زرد متمایل به قهوه ای و کنیدیوفورها دارای انشعابات فراهم بودند. استخراج dna از جدایه های قارچی با روش ctab صورت گرفت. مطالعه تنوع ژنتیکی جدایه ها، بر روی نواحی rdna-its و با استفاده از نشانگر pcr-rflp بایک جفت آغازگر عمومی یوکاریوت ها (ab28,tw81) انجام شد. این جفت آغازگر در طی واکنش pcr در تمامی جدایه ها یک قطعه در محدوده 600 جفت بازی را تکثیر کرد. محصولات pcr بوسیله 13 آنزیم برشی شاملecor ?, hpyf3?, apa ?, hinf ?, mbo ?, msp ?, mse?, rsa?, not ?, pst ?, bamh ?, hind ???, dra ? هضم و محصولات هضم روی ژل آگارز 2 درصد تفکیک شدند. نتایج هضم آنزیمی نشان داد که فقط هفت آنزیم برشی ecor ?, hpyf 3?, apa ?, hinf ?, mbo ?, msp ?, mse ? دارای محل برش روی قطعه مزبور بودند. نتایج حاصل از هضم آنزیمی درجه بالایی از چند شکلی را در جدایه های مختلف نشان دادند. با استفاده از آنالیز خوشه ای داده های حاصل از هضم برمبنای ضریب الگوریتم upgma و ضریب تشابه جاکارد، جدایه ها با سطح تشابه 70 درصد در 9 گروه قرار می گیرند. نتایج نشان داد که آنزیم mbo ? نسبت به بقیه آنزیم ها مناسب تر است و جدایه های منطقه رفسنجان نسبت به مناطق دیگر از تنوع بیشتری برخوردار هستند. محصول pcr پنج جدایه بطور تصادفی برای توالی یابی مورد استفاده قرار گرفت که توالی های حاصل با توالی های مربوط به قارچ های دیگر موجود در بانک ژن بالای 90 درصد همولوژی نشان دادند. طبق این نتایج مشخص شد که نواحی تکثیری در واکنش pcr مربوط به قسمتی از نواحی انتهایی ´5 زیر واحد 18s ،و نواحی کامل its1 ، زیر واحد 5.8s ، its2 و قسمتی از نواحی ´5 زیر واحد 28s می باشند. آنالیز صفبندی مربوط به پنج توالی منتخب نشان داد که بیشترین همولوژی (98?) بین جدایه های x3 و k2 وجود دارد. آنالیز فیلوژنی و رسم درخت فیلوژنی نیز بیشترین شباهت را بین دو جدایه x3 و k2 و به مقدار 99 درصد نشان داد. در مجموع نتایج حاصل از آنالیز فیلوژنی به طور مشخصی نتایج pcr-rflp را تائید می کند. نتایج این تحقیق نشان می دهد با توجه به اینکه جدایه های هر منطقه در دودمان کلونی همان منطقه قرار گرفتند، بین جدایه های هر منطقه رابطه اختصاصی وجود دارد ولی بین پراکنش و تنوع جدایه های قارچی و فواصل مناطق جغرافیایی مختلف استان کرمان هیچ رابطه ای مشاهده نشد. بنابراین ما نمی توانیم بیان کنیم که با افزایش یا کاهش فاصله دو منطقه از هم سطح شباهت جدایه ها افزایش یا کاهش پیدا می کند. باید عنوان کرد که با وجود اینکه این قارچ به عنوان یک عامل فرصت طلب روی گیاهان ضعیف عمل می کند، اما خسارت زیادی وارد کرده و روز به روز درصد تنوع این قارچ در سطح استان بیشتر می شود. با توجه به گروه بندی جدایه ها، ممکن است شیوه مبارزه با این عامل بیماری در مناطق مختلف و بسته به شرایط آب و هوایی آن منطقه متفاوت باشد.